细胞培养的时候，最怕遇到啥？当然是细胞分布不均匀啦！细胞分布那些常见的“坑”，还有超实用的解决方法，快拿小本本记好啦！

一、细胞随机分布：单细胞悬液的“小秘密”

细胞在培养板中出现随机分布，那可太让人头疼啦！这种情况通常是由于以下原因导致的：

• 细胞吹散不充分：铺板前，细胞没被彻底吹散成单细胞悬液，细胞团块在铺板后迅速生长，局部细胞密度过高，其他区域则细胞稀疏。

• 消化过程不均匀：胰酶作用时间或浓度控制不当，细胞成片脱落，铺板后形成高密度细胞区域，严重影响实验结果。

为了避免这个问题，宝子们可以试试这些方法：

• 优化消化过程：用不含EDTA的胰酶，严格控制胰酶用量和浓度，建议稀释后使用，避免过度消化。

• 彻底吹散细胞悬液：铺板前，用移液管或细胞吹打器，将细胞悬液充分吹散，至少吹打20次以上，保持均匀力度。

• 铺板后显微镜检查：铺板完成后，立即在显微镜下观察细胞分布情况，发现不均匀或团块，立即重新铺板。

二、细胞分布边缘多中间少：96孔板的“弯液面”现象

在96孔板中，细胞分布边缘多、中间少，这可太常见啦！主要原因有：

• 液体体积不足：孔径小，液体体积不够，形成弯液面现象。

• 加液速度过快：快速加液干扰孔内液体表面张力，细胞被拉拽到边缘。

• 孔内表面张力不均匀：液体体积不足和加液速度过快共同作用，加剧细胞向边缘聚集。

解决办法也很简单：

• 确保液体体积充足：每个孔加入200 μL液体，减少弯液面现象。

• 优化加液操作：沿孔壁缓慢打出液体，速度控制在50 μL/秒左右，避免表面张力剧烈变化。

• 其他建议：使用多道移液器，确保液体体积一致，加液前预平衡培养板，定期检查移液器。

三、细胞分布边缘少中间多：24孔板和6孔板的“中央聚集”现象

在24孔板和6孔板中，细胞分布边缘少、中间多，这可太让人头疼啦！主要原因有：

• 加液方式不当：液体沿着孔壁某一点持续打出，反向流至中央区域。

• 液体流速过快：快速打出的液体冲击力强，细胞被推向中央。

• 孔径较大：孔径大，液体流动更容易受加液方式和速度影响。

解决办法也很简单：

• 优化加液点的选择：在孔内选择3-4个不同点分次打出细胞悬液，分散液体冲击力。

• 控制加液速度：降低打出悬液的速度，让液体缓慢流至孔底并均匀铺开。

• 使用移液技巧：采用“点式加液”方法，每次打出少量液体，轻轻晃动移液器，使液体均匀分布。

四、如何摇晃孔板促进均匀：不同孔板的“摇晃秘籍”

摇晃孔板也是促进细胞均匀分布的关键步骤哦！不同孔板有不同的摇晃方法，宝子们可得记好了。

96孔板

• “十”字形摇晃：将孔板平放在实验台上，用手指轻轻捏住边缘，轻缓地画“十”字形，每轮10-15秒，重复2-3轮。

• “∞”字形摇晃：同样轻缓地画“∞”字形，每轮10-15秒，重复2-3轮，进一步促进液体均匀分布。

24孔板和6孔板

• 轻拍孔板侧边：一只手扶住孔板一侧，另一只手轻轻拍打另一侧，力度适中，每次5-6次，重复2-3轮。

• 小幅度晃动：在轻拍基础上，轻轻晃动孔板，幅度小，避免液体洒出，沿着长轴或短轴方向晃动，每次10-15秒，重复2-3轮。

注意事项

• 摇晃后的静置：摇晃后静置至少15分钟，让液体均匀分布，细胞均匀附着。

• 操作环境：在无菌环境中操作，佩戴无菌手套，避免污染。

• 液体体积控制：加液时确保每个孔液体体积一致，96孔板每个孔200 μL，24孔板和6孔板根据实验需求调整。

• 定期检查：定期在显微镜下观察细胞分布情况，及时发现并解决问题。