实操步骤：步步为营，细节决定成败

1️⃣灭菌：打造无菌环境

灭菌是细菌培养的第一步，也是最重要的一步。高压蒸汽灭菌（121℃、30分钟）能有效杀灭细菌芽孢和其他微生物。超净工作台使用前，用紫外线灯照射30分钟，破坏微生物的DNA，确保操作环境无菌。

2️⃣倒平板：为细菌准备“家”

倒平板时，要根据细菌的生长需求调整平板厚度。大肠杆菌生长快，每平板倒入10mL培养基，厚度约3-4mm；鸟分枝杆菌生长慢，需要20mL培养基，厚度约5-6mm，以提供更充足的营养和稳定的环境。

3️⃣活化与接种：启动细菌生长

菌种可来自平板或-80℃保存的菌种库。操作前，关闭超净工作台的紫外线，打开通风系统。点燃酒精灯，将接种环烧红灭菌，冷却后挑取适量菌落或菌液进行划线接种。划线能让菌液在培养基表面均匀分布，形成独立菌落，方便后续观察和分离。

4️⃣培养：让细菌茁壮成长

培养时，先用封口膜封好培养基，防止污染。将培养基正置放入37℃恒温培养箱中培养30分钟，让培养基表面水分均匀分布，然后倒置培养，防止冷凝水倒流，便于菌落形成和观察。

5️⃣观察：了解细菌生长情况

不同细菌生长速度不同，观察时间也不同。大肠杆菌生长快，12-16小时后就能看到菌落；鸟分枝杆菌生长慢，需要1-4周才能看到明显生长迹象。通过观察菌落的形态、颜色、大小，可以初步判断细菌的种类和生长情况。

6️⃣液体培养：扩大细菌数量

当平板上长出单菌落时，就可以进行液体培养，扩大细菌数量。将液体培养基倒入无菌离心管或试管，用灼烧灭菌后的接种环挑取单菌落放入液体培养基中，封口膜封好，放入恒温摇床中培养。摇床通过振荡让菌液与培养基充分接触，提供氧气和营养，促进细菌快速生长。

避坑指南：这些“雷区”不要踩

1️⃣无菌操作：别让杂菌搅局

细菌培养时，无菌操作是核心要求，必须严格遵守。杂菌一旦混入，会和目标细菌抢营养，甚至释放有害物质，让实验结果乱成一团。

2️⃣pH值调节：给细菌合适的生长条件

灭菌前，调节培养基的pH值是必须的，因为细菌对环境酸碱度很敏感。大多数细菌喜欢中性或微碱性环境。

3️⃣试剂添加时机：把握好关键节点

抗生素、增菌液等试剂的添加时机很重要。这些试剂要在培养基冷却到手能触碰时加入。如果加入过早，高温会破坏试剂的活性；如果加入过晚，培养基已经凝固，试剂就无法均匀分布，效果也会大打折扣。

4️⃣特殊细菌处理：小心应对“难搞分子”

对于一些特殊细菌，比如鸟分枝杆菌，要格外小心。这种细菌生长慢，需要更多营养和更稳定的环境。所以要按照说明书加入增菌液和抗生素，倒厚平板，增加培养基的量，满足它的生长需求。另外，鸟分枝杆菌有潜在感染性，操作时要格外注意。使用前，必须在60℃水浴中灭活30分钟，消除感染性；操作时要在生物安全柜里进行，防止对人员和环境造成危害。