Western Blot实验中蛋白降解的原因与机制

蛋白降解的生化机制

蛋白酶：无情的"剪刀手"

蛋白酶就像分子世界的"剪刀手爱德华"，它们专门切割蛋白质的肽键！我们的细胞内本身就存在大量蛋白酶，它们在细胞破碎后会被释放出来，开始疯狂"剪切"我们宝贵的目标蛋白～

想象一下，当你把细胞裂解后，就像打开了装满剪刀的抽屉，如果不及时"收走剪刀"（抑制蛋白酶），那么你的目标蛋白就会被剪得七零八落！

不同蛋白酶有不同的"口味"：

•丝氨酸蛋白酶喜欢切割特定氨基酸位点

•金属蛋白酶需要金属离子协助工作

•半胱氨酸蛋白酶依赖还原环境活化

氧化作用：蛋白质的"锈蚀"过程

氧化作用就像是蛋白质的"生锈"过程。当蛋白质暴露在氧气中时，尤其是含有巯基(-SH)的氨基酸（如半胱氨酸）极易被氧化，形成二硫键，导致蛋白结构改变。

这种氧化会引起：

•蛋白质空间构象变化

•聚集形成高分子复合物

•抗原表位变化，影响抗体识别

就像你的铁制品放久了会生锈一样，蛋白质在不当环境中也会"生锈变质"哦～

导致蛋白降解的关键环节

1️⃣ 样品制备阶段的"致命伤"

样品制备是蛋白降解的高发区！想象一下，当细胞被裂解的那一刻，就像一座城市的围墙被攻破，所有的"坏人"（蛋白酶）都跑出来了！

常见问题：

•裂解液中缺少蛋白酶抑制剂

•操作温度过高（室温操作简直是犯罪！）

•裂解时间过长，给蛋白酶"充分工作时间"

•机械力过大导致热量产生

2️⃣ 储存条件：蛋白的"保鲜"危机

蛋白质样品就像是精致的海鲜，保存不当分分钟变质！

常见错误：

•反复冻融（每冻融一次，降解风险+50%！）

•储存温度不够低（-20℃对某些蛋白来说根本不够！）

•储存容器不合适导致氧化

•保存时间过长

3️⃣ 电泳过程中的隐形杀手

别以为把样品放进凝胶就安全了，电泳过程中的温度升高是蛋白质的另一个"噩梦"：

•电压设置过高导致温度升高

•电泳时间过长

•缓冲液配制错误改变pH值

4️⃣ 温度波动：蛋白质的"过山车"体验

蛋白质最怕的就是温度的忽高忽低：

•从冰箱取出后长时间放置

•实验过程中温度控制不严格

•在不合适温度下进行操作步骤

这就像我们人不能忽冷忽热一样，蛋白质也经不起这种"温度过山车"！

如何判断蛋白是否降解？

怎么知道你的蛋白是否已经"遭遇不测"呢？有这些信号：

•条带下方出现smear拖尾（就像蛋白质的"眼泪"）

•出现预期之外的低分子量条带

•目标条带信号减弱

•内参蛋白也出现异常