蛋白纯化大作战!添加剂选对,效率翻倍
Thu Sep 11 00:00:00 CST 2025毕合生物|MBC新闻编辑
做蛋白纯化的小伙伴一定都经历过那种崩溃时刻:明明柱子平衡好了,上样操作也没问题,最后目标蛋白要么沉在离心管底,要么活性全无。十有八九,问题出在添加剂上。添加剂虽然在实验方案里只有几行字,但选对了能直接让纯化效率翻倍,选错了可能几天的细胞培养和裂解工作全白费。蛋白纯化里常用添加剂的挑选门道,全是实操干货,帮你避开那些没必要的坑!
1. 盐类添加剂:不是越多越好,看蛋白“体重”下菜
盐类添加剂里最常见的就是氯化钠,它的核心作用是通过改变溶液离子强度,调节蛋白溶解度。很多新手会踩一个误区:觉得盐加得越多,蛋白越容易溶解。其实真相是——低离子强度时,蛋白表面电荷没被中和,反而容易“抱团”沉淀;高离子强度下,溶液里的离子能裹住蛋白电荷,减少分子间静电作用,蛋白才更易舒展溶解。
关键是得看蛋白分子量:像胰岛素(约5.8 kDa)这种小分子蛋白,根本扛不住高盐,浓度超0.2M就可能沉在管底;而免疫球蛋白G(约150 kDa)这种大分子蛋白,反而喜欢0.5M左右的盐浓度,溶解度能保持稳定。实操里最常用的场景是离子交换层析,比如纯化血清白蛋白时,得先配0.1M、0.2M、0.3M等不同浓度的氯化钠溶液,用起始浓度平衡柱子后上样,再以1 mL/min的流速梯度提盐浓度,盯着检测器收目标蛋白峰就行。
2. 缓冲剂:蛋白的“稳定器”,选对pH是关键
缓冲剂的作用就像给蛋白搭“舒服的家”,通过提供或消耗氢离子,稳住溶液pH——毕竟蛋白对pH敏感得很,稍微偏一点,结构和活性可能就没了。选缓冲剂的核心原则,是匹配目标蛋白的等电点。
比如碱性蛋白组蛋白(等电点约10.5),就得用酸性缓冲液(像pH 5.0的醋酸缓冲液),不然难溶解;酸性蛋白血清白蛋白(等电点约4.7),则得用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液。而且不同缓冲剂有固定适用范围:Tris-HCl适合7.5-8.5的pH区间,多用于碱性蛋白;磷酸盐缓冲液(PBS)pH约7.4,更适合中性蛋白。之前见过有人纯化胰蛋白酶,明明知道这酶在pH 7.5-8.0活性最高,却错用了pH 6.0的醋酸缓冲液,最后酶活连一半都不到,纯属白忙活。
3. 表面活性剂:膜蛋白的“解放者”,浓度不能瞎凑
表面活性剂是膜蛋白纯化的“刚需”——膜蛋白躲在细胞膜磷脂双层里,不用它根本拽不出来。常用的Triton X-100属于“温和派”,1%-2%的浓度就能拆解开细胞膜,还能防止蛋白聚集;但有些娇气的蛋白连Triton X-100都受不住,这时候就得换更温和的CHAPS。
这里最容易踩的坑是浓度:太高会让蛋白变性,太低又拆不开细胞膜。之前有个同事做膜蛋白纯化,图省事加了0.5%的Triton X-100裂解细胞,离心后上柱,结果检测器里几乎没峰——后来才发现浓度不够,细胞膜没拆透,蛋白全裹在膜碎片里沉底了。正确操作应该是:裂解液里加好表面活性剂和蛋白酶抑制剂,和细胞悬液混合后轻轻搅拌或超声,再10000 g离心30分钟,取上清做后续纯化,一步都不能省。
4. 还原剂:拆二硫键的“工具人”,别忘了后续处理
还原剂比如DTT、β-巯基乙醇,专管蛋白的“二硫键麻烦”。二硫键是把双刃剑:能帮蛋白稳住结构,但有时候会让蛋白片段互相缠绕,影响纯化——比如纯化Fab抗体片段时,二硫键多了会导致片段分不开,纯化效率大降。这时候还原剂就能派上用场,通过提供巯基(-SH),把二硫键拆成两个巯基,让蛋白“松绑”。
但用还原剂有两个关键点:一是反应条件,室温或37°C下反应30分钟到1小时就行,时间太长会过度还原;二是反应完必须去掉还原剂,不然会干扰后续实验。还有种特殊情况:如果酶的活性依赖特定二硫键,还原后得重新氧化,不然酶会直接“哑”掉。之前有人纯化氧化还原酶,忘了这一步,最后酶活为零,查了半天才找到原因。
添加剂挑选的核心逻辑:别“一刀切”,按需调整
选添加剂不是照抄方案,得根据三个维度调整,才能不踩坑。
首先看目标蛋白特性
分子量小的怕高盐,等电点低的爱碱性缓冲液,敏感蛋白还得全程4°C操作。比如有种酸性蛋白,分子量50 kDa、等电点5.5还怕热,就得用0.2M NaCl搭配pH 8.0的Tris-HCl,再加1 mM DTT防氧化,所有步骤都在4°C冰箱里做,不然蛋白要么沉要么失活。
再看纯化方法
亲和层析最怕高盐,比如用蛋白A纯化IgG,高盐会让两者脱钩,所以平衡和上样都得用pH 8.0的Tris-HCl,洗脱时才用低pH的柠檬酸缓冲液,而且洗脱后得马上中和,防止蛋白变性;离子交换层析则相反,阳离子交换针对碱性蛋白,阴离子交换针对酸性蛋白,都得靠梯度加盐分开蛋白。
最后看后续应用
要测酶活性,就得用酶的最适pH缓冲液,比如胰蛋白酶得用pH 7.5-8.0的Tris-HCl,再加0.1M NaCl和1 mM DTT保活性;要做X射线晶体学这类结构分析,就得用低浓度盐(比如0.05M NaCl)和pH 7.0-7.5的磷酸盐缓冲液,不然蛋白难结晶。