细胞传代是啥？

细胞传代就是把生长到一定密度的细胞从原培养容器中分离出来，重新接种到新的培养容器中继续培养。简单来说，就是给细胞换个“新家”，让它们能更好地生长和繁殖。就像我们住的房子太挤了，需要换个大房子一样。

贴壁细胞传代步骤

1️⃣ 观察细胞状态

每天用倒置显微镜观察细胞，当细胞融合度达到80% - 90%时，就可以传代啦。细胞融合度过高，细胞会太挤，影响生长哦。

2️⃣ 准备工作

• 把PBS、胰蛋白酶-EDTA消化液和完全培养基放在37℃水浴锅中预热。

• 把要用的耗材（如移液管、离心管、培养瓶等）用75%酒精消毒，放在超净工作台里。

3️⃣ 消化细胞

• 先把培养瓶中的旧培养基吸掉，注意别吸走细胞。

• 用1×PBS轻轻清洗细胞一次，去除残留的培养基和血清。

• 加入适量胰蛋白酶-EDTA消化液，覆盖细胞表面，然后把培养瓶放回37℃培养箱中消化1 - 2分钟。记得根据细胞类型调整消化时间哦。

4️⃣ 终止消化

• 在显微镜下观察细胞，当细胞开始变圆、从培养皿表面脱落时，迅速加入适量完全培养基，轻轻吹打混匀，终止胰蛋白酶的消化作用。

• 把消化后的细胞悬液转移到15mL离心管中，轻轻吹打混匀，让细胞完全分散。

5️⃣ 离心收集

• 在室温下以1000rpm（约120×g）离心5分钟。

• 小心弃去上清液，别把细胞沉淀吸走了。

6️⃣ 重悬与分瓶

• 用新鲜培养基重悬细胞，轻轻吹打混匀，让细胞均匀分散。

• 根据传代比例（如1:2或1:3），把细胞悬液分装到新的培养瓶中，每个培养瓶加入适量完全培养基（如T25瓶加5mL）。

7️⃣ 培养与观察

• 把新的培养瓶放回37℃、5% CO₂培养箱中继续培养。传代后的细胞通常在24 - 48小时内重新贴壁生长，记得观察细胞形态是否恢复正常。

悬浮细胞传代步骤

悬浮细胞传代相对简单，当细胞密度达到80% - 90%时，可以直接传代。

1️⃣ 收集细胞

• 把培养瓶中的细胞悬液转移到离心管中。

• 以500g离心5分钟，轻轻倒出上清液。

2️⃣ 重悬与分瓶

• 加入适量完全培养基，轻轻吹打混匀，让细胞完全分散。

• 根据传代比例（如1:2或1:3），把细胞悬液分装到新的培养瓶中，每个培养瓶加入适量完全培养基（如T25瓶加5mL）。

3️⃣ 培养与观察

• 把新的培养瓶放回37℃、5% CO₂培养箱中继续培养。传代后的细胞通常在24 - 48小时内恢复正常生长，记得观察细胞形态是否良好。

注意事项

• 避免过度消化：过度消化会让细胞膜受损，影响细胞活性。根据细胞类型调整消化时间。

• 温和操作：吹打细胞时，用宽口移液管，沿瓶壁缓慢吹打，别垂直吹打，避免细胞损伤。

• 细胞计数：传代前数一下细胞，确保细胞浓度合适，别太稀或太密。

• 记录传代次数：每次传代后记录次数，防止细胞发生遗传漂变。

如何判断细胞是否消化完成？

1️⃣ 显微镜下观察细胞形态

• 细胞变圆，间隙变大，大部分细胞开始脱落，轻拍培养瓶壁，细胞像“流沙”一样脱落，就说明消化完成了。

2️⃣ 观察培养基流动状态

• 粘滞型（流速＜2cm/s）：消化时间不够，延长1 - 2分钟。

• 丝状分流（形成3 - 5条流线）：消化完成，立即终止。

• 镜面流动（流速＞5cm/s）：可能过度消化，需紧急处理。

3️⃣ 吹打阻力变化

• 第一次吹打有明显贴壁感（阻力值约2N），说明细胞还贴壁。

• 第三次吹打阻力降至0.5N以下，说明细胞消化完成。

4️⃣ 离壁率计算

离壁率 = （悬浮细胞数/总细胞数）×100%。当离壁率达到75% - 85%时，说明细胞消化完成，立即加入终止液。

5️⃣ 温差预判法

• 细胞在10秒内重新贴壁：消化不足，继续消化。

• 细胞维持悬浮状态：消化完成，终止消化。