模板DNA的问题

1️⃣浓度不合适

模板DNA浓度过高，Taq酶会被过度占用，导致非特异性扩增增多；浓度过低，PCR产物扩增不完全，得率低甚至无产物。所以，要通过预实验找到合适的模板浓度哦。

2️⃣纯度不够

模板DNA中的杂质，比如蛋白质、多糖、酚类物质等，会抑制Taq酶活性，甚至使其变性失活。在正式实验前，可以通过测量260/280比值和260/230比值来判断模板DNA的纯度，比值合适才表示纯度良好。

引物设计不当

1️⃣长度和GC含量

引物长度18-25bp比较合适，过短易致非特异性结合，过长则会使引物与模板结合困难。GC含量应保持在40%-60%，过低会降低引物与模板的结合力，过高则可能引发非特异性扩增。

2️⃣结构和修饰

引物设计要避免互补序列，防止形成引物二聚体或发夹结构。引物3’端不可修饰，否则会阻碍DNA聚合酶延伸。

3️⃣Tm值

上下游引物Tm值应保持在55-75℃，且相差不超过2℃。过低的Tm值会使引物与模板结合不稳定，易受干扰致非特异性扩增；过高则会使引物难以从模板解离，影响扩增循环和产物得率。

各种浓度用量不精准

1️⃣酶浓度

Taq DNA聚合酶浓度过低，扩增效率降低；浓度过高，则易引发非特异性扩增。

2️⃣dNTP浓度

4种dNTP浓度要均衡，否则易导致错配，且浓度过低的dNTP会限制DNA合成速度和产量。

3️⃣Mg²⁺浓度

Mg²⁺浓度过高会降低引物结合严谨性，引发非特异性扩增；浓度过低则会使Taq酶活性降低，扩增效率下降。

参数设置偏差

1️⃣退火温度

退火温度过低，引物与模板结合过于宽松，易引发非特异性扩增；温度过高，引物又难以与模板有效结合。建议通过梯度PCR测试不同退火温度下的扩增效果，找到最佳退火温度。

2️⃣扩增时间

扩增时间过短，DNA聚合酶无法完成目标片段复制；时间过长，又易引发非特异性扩增。特别是扩增短片段时，过长的延伸时间会显著增加非特异性条带出现的几率。

3️⃣循环次数

循环次数不足，产物量低；次数过多，易引发错配和非特异性扩增。通常30-40个循环比较合适。

“救星”添加剂

当PCR实验陷入困境时，添加剂就像是神奇的“救星”。比如，二甲基亚砜（DMSO）能破坏DNA双链氢键，降低GC富集区解链温度；甜菜碱能削弱GC碱基对氢键作用，均一化DNA链Tm值；BSA能中和酚类残留，保护Taq酶活性。