有没有被连接反应虐到怀疑人生？载体自连、插入失踪、转化白板……

️温度玄学：25℃只是起点！

连接酶最适25℃，但平末端建议“两段式”：先室温10 min激活，再4℃过夜慢炖❄️。别小看这步，平末端效率能翻3倍！高温？直接让酶热到罢工。

摩尔比=成功密码

单片段插入记住“载体:插入=1:3~1:10”，超过1:10载体自闭给你看！小技巧：用Nanodrop算浓度别手抖，平末端可加少许切割酶防自连⚡。

浓度陷阱：太浓太稀都不行

总DNA 5-10 μg/mL是甜蜜点！举个栗子：50 μL体系里，载体+插入别超0.5 μg。平末端偷偷加0.1U载体酶，自连率直降80%！

缓冲液暗藏彩蛋

ATP 0.5-1 mM刚好，多了抑制反应！ATP缓冲液分装-20℃冻存，避免反复冻融。升级配方：加1 μL 0.1% BSA，酶活性稳如老狗。

️酶的选择：T4还是高保真？

T4 DNA连接酶万能选手，长片段/复杂结构换NEBuilder高保真，错误率低到0.1%！平末端救星：1 mM DTT+5% PEG-8000，效率飙升50%。

转化前必做：灭活内切酶！

热灭活65℃ 20 min（T4适用），或柱纯化/乙醇沉淀去残留酶活。终极杀招：连接产物跑胶回收，纯度99%+。

实战案例：平末端从20%→85%

原条件25℃ 1 h效率20%，优化后：载体:插入=1:5+5% PEG-8000+4℃过夜+65℃热灭活，转化子数量翻4倍！菌落PCR阳性率85%

连接反应配方（50 μL体系）

T4连接酶1U+10×缓冲液1×+载体50 ng+插入150 ng+PEG-8000 5%+ddH₂O补至50 μL，冰上操作别手抖！

⚠️避坑三连

❌ 反复冻融连接酶（活性暴跌！）
❌ 平末端用Taq产物（A尾干扰！）

❌ 感受态OD600>0.6（效率腰斩！）